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上海生科院揭示胸腺嘧啶水解酶底物特异性的分

2019-10-07 01:26
维生素C参与产生一种全新的DNA修饰

表观遗传的魔力

10月1日,国际学术期刊Nucleic Acids Research 在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心丁建平研究组的最新研究成果:Molecular basis for the substrate specificity and catalytic mechanism of thymine-7-hydroxylase in fungi,该研究工作揭示了真菌胸腺嘧啶水解酶T7H底物特异性的分子基础和催化机制。

5月2日,国际权威学术期刊《自然》在线发表了来自中科院上海生物化学与细胞生物学研究所徐国良院士联合复旦大学唐惠儒教授和中科院武汉水生生物研究所黄开耀研究员等多个课题组合作完成的研究成果“A vitamin-C-derived DNA modification catalysed by an algal TET homologue”。该研究首次在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)这种单细胞真核生物中鉴定到一种新型的TET同源蛋白,并发现该蛋白可以将维生素C的碳基骨架转移到DNA上,产生一种全新的DNA修饰。文章详细阐述了维生素C直接参与该DNA修饰的反应机理,并揭示这一蛋白及其产生的DNA修饰在调节莱茵衣藻光合作用过程中的重要作用。

自从DNA双螺旋结构被解析以及中心法则的提出,人们已经认识到DNA作为遗传物质的重要性。以人类为例,DNA序列决定了蛋白质的氨基酸序列,并最终导致不同生命个体之间的差异。那么问题来了, DNA序列完全一致的细胞是否就完全相同呢?

DNA胞嘧啶的甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在很多生物学过程中发挥重要作用,属于双加氧酶家族的TET蛋白参与了DNA的主动去甲基化过程。哺乳动物中TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶到5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的多步氧化反应,该催化过程与真菌中胸腺嘧啶水解酶T7H催化的从胸腺嘧啶到5-羟甲基尿嘧啶、5-醛基尿嘧啶和5-羧基尿嘧啶的多步氧化反应过程在化学特性上存在很多相似之处,且TET和T7H均为双加氧酶超家族成员。虽然TET蛋白与包含5mC修饰碱基的DNA复合物的晶体结构已经被报道,但TET蛋白识别和区分胞嘧啶C5位不同修饰基团以及催化5mC发生连续氧化反应的分子机制仍不清楚。因此,研究T7H的底物特异性识别和催化机制可以增进对TET蛋白结构和功能的理解。

徐国良研究组长期致力于DNA修饰酶和新修饰的发现工作,对哺乳动物DNA去甲基化过程中产生的DNA修饰及其生物学功能进行了深入研究。在真核生物中,DNA修饰的最主要形式是5-甲基胞嘧啶。

答案自然是否定的。

丁建平研究组的博士研究生李文婧等人解析了真菌5533美高梅官方网站,Neurospora crassa来源的胸腺嘧啶水解酶T7H的原酶形式、辅因子a-KG结合形式以及不同底物结合形式(结合a-KG和T、5hmU或5fU)的高分辨率的晶体结构。结构和生化分析结果表明,T7H只能在辅因子存在的情况下结合底物,且不同底物的结合不会导致活性位点发生显著构象变化。活性位点的氨基酸残基Phe292、Tyr217和Arg190在底物结合、催化反应过程中发挥重要作用。T7H与不同底物之间略有差异的亲和力和催化活性受到底物C5位修饰基团与辅因子和蛋白之间相互作用的影响。催化反应结束后,产物被首先释放,然后新的辅因子和底物结合到T7H的活性位点开始新的氧化反应。此外,T7H与TET蛋白的结构比较阐明了T7H催化游离碱基而非DNA中修饰碱基的结构基础。这些研究成果揭示了T7H底物特异性的分子基础和催化机制,并为TET蛋白底物特异性的分子基础和催化机制提供了新的见解。

近年来,包括徐国良研究组在内的三个实验室发现TET双加氧酶可以将5mC依次氧化产生5-羟甲基胞嘧啶 、5-醛基胞嘧啶 、5-羧基胞嘧啶 。后两种修饰经由胸腺嘧啶DNA糖苷酶耦联的碱基切除修复或DNA复制等途径从基因组上被移除,完成DNA去甲基化过程。但有关TET双加氧酶在进化过程中的保守性,以及其在低等生物中的酶活与功能还有待进一步探索。

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上海同步辐射光源17U线站和国家蛋白质科学研究设施19U线站在实验数据收集中提供了支持与帮助。该项研究工作得到了国家科技部、国家自然科学基金委和中国科学院的经费支持。

在最新发表的工作中,研究者以莱茵衣藻作为模式生物,鉴定到了8个TET同源蛋白。通过蛋白纯化以及酶活分析,他们发现其中的CrTET1 可以将DNA上的5mC转变为两种不同的修饰碱基,CrTET1也因此被重新命名为CMD1 (5-methylcytosine modification enzyme 1)。进一步的研究表明,这两种新修饰都是在5mC的甲基碳上增加了一个甘油基,二者由于空间结构的差异而互为立体异构体,因此将其统一命名为5-甘油基-甲基胞嘧啶。

图片来源于网络

这也是除了目前已知的5mC、5hmC、5fC、5caC、6mA、5hmU和base J以外,在真核生物中发现的第8种DNA碱基修饰。更加意外的是,在研究5gmC上甘油基的来源时,研究者发现在传统双加氧酶反应中所必需的α-酮戊二酸在CMD1酶催化反应中可有可无,取而代之的是另一个十分重要的小分子:维生素C。维生素C不仅通过提供电子参与CMD1的催化过程,还直接将自身的甘油基团转移到5mC的甲基碳上,形成新的DNA修饰。研究者进一步解析了CMD1催化5mC与维生素C反应的化学机理,证实乙醛酸与二氧化碳为反应的副产物,从而揭示了一条全新的酶催化途径。通过在莱茵衣藻中开发高效的基因编辑方法,研究者获得了CMD1基因突变藻株。

我们每个人都是从受精卵发育而来,理论上身体的每一部分都共享着相同的DNA序列,但我们体内的细胞类型、组织和器官却大相径庭,而决定这种差异的最主要原因就在于它们拥有完全不同的“表观遗传”信息。

CMD1突变藻株在强光照射下的适应能力明显减弱,这可能是由于CMD1突变造成一部分基因的甲基化水平升高,使得包括与适应强光有直接关系的LHCSR3在内的多个基因的表达受到了抑制,导致光合作用的负反馈调节作用减弱。这项工作不仅首次报道了一种全新的DNA修饰5gmC,同时报道了由维生素C介导的一种全新的酶活反应类型,阐述了CMD1及其催化产物5gmC在光合作用过程中的重要调控功能。这些研究丰富了我们对DNA修饰多样性的认识。

DNA上存在的不同的化学修饰就是一种主要的“表观遗传”信息,这些DNA修饰就像流水线上的机械手,在特定时间指导细胞让不同的基因“打开”或“关闭”,并影响哺乳动物的胚胎发育、疾病的发生发展等进程。

据悉,中科院生化与细胞所薛剑煌、陈国栋、陈辉以及武汉物理与数学研究所豪富华为该论文的共同第一作者。徐国良研究员、复旦大学生命科学学院唐惠儒教授以及中科院水生生物研究所黄开耀研究员为共同通讯作者。

DNA修饰的种类虽少,但作用可不小

参与这项工作还有中科院生化与细胞所丁建平、陈洛南,中科院上海有机所刘文、朱正江,中科院营养与健康研究所尹慧勇,上海师范大学马为民,德国RWTH Aachen University的Elmar Weinhold,美国University of Pennsylvania的Rahul M. Kohli等数十个课题组。这项工作得到了中科院生化与细胞所分子平台、植生所质谱平台、马普计算所计算生物学实验技术平台的大力支持,以及来自中科院、科技部和基金委的经费支持。

既然DNA修饰如此神奇,那细胞内到底有多少种DNA修饰?与种类繁多的RNA修饰相比,在真核细胞内,DNA上的修饰种类屈指可数。

相关论文信息:

随着近年来对表观遗传学的深入理解,科学家已经在真核生物中鉴定到了7种DNA修饰碱基。除了上个世纪就已经被发现的5mC,5hmU以及base J以外,近十年来又发现哺乳动物中的TET双加氧酶可以将5mC逐步氧化产生5hmC,5fC以及5caC,同时还在高等生物中鉴定到了6mA的广泛分布。

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真核生物中的DNA修饰

虽然DNA修饰的种类不多,但功能可真不容小觑。由不同原因引起的5mC的氧化修饰失调会造成小鼠早期胚胎发育异常,例如智力低下、白血病等癌症发病率升高等不良后果。6mA也被发现在实体肿瘤中高度富集。

因此,进一步研究DNA修饰的功能,探索是否还存在其它DNA修饰形式,也是科学界的研究热点之一。

维生素C的功能,你可能不够了解

近日,中科院分子细胞科学卓越创新中心/生化与细胞所徐国良院士联合复旦大学唐惠儒教授和中科院水生所黄开耀研究员等多个课题组在国际学术期刊Nature上发表最新研究成果,首次报道了一种由维生素C产生的DNA修饰,并阐释了其在调节莱茵衣藻光合作用中的功能。

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在这项工作中,研究人员在莱茵衣藻中发现一个独特的生物酶CMD1,它可以催化产生两种新的DNA修饰,它们互为立体异构体,并被统一命名为5gmC。更令人诧异的是,维生素C直接参与了这种修饰,并将其结构上的甘油基部分转移到DNA上。

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CMD1催化维生素C参与DNA修饰

为了研究CMD1蛋白及其产生的5gmC修饰的功能,科学家通过基因敲除技术获得CMD1基因突变藻株,发现这种突变藻株对强光的适应能力明显减弱。其主要原因在于,衣藻内的DNA修饰发生改变后,包括光合作用相关基因在内的许多基因的表达谱受到影响,衣藻光合作用的调控过程变得紊乱,细胞过度吸收的光能无法被有效释放,导致有害电子堆积,对细胞造成巨大损伤。

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CMD1以及5gmC参与莱茵衣藻光合作用的反馈调节

这是科学家在真核生物中鉴定到的第8种DNA修饰,同时解析了其参与的生理调控,为表观遗传学的研究打开了一扇新的大门。而日常被认为是抗氧化剂的维生素C在其中的意外“登场”,也让大家认识到它或许还有更多的隐藏“技能”。维生素C与基因的“结合”过程作为一类新的化学反应,也可能为生化大分子的合成提供新的研究思路。

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